摘要

　　由于高危人群对LDCT筛查的依从性和接受程度较差，肺癌通常在晚期才被诊断出来，而晚期肺癌很难治愈。根据美国放射学会的肺成像和报告数据系统（Lung- RADS）， 80-90%的筛查患者将出现临床“无需干预”的结节，而那些较大的“需要手术干预”结节的患者患肺癌的风险明显更高。为此我们开发一种辅助诊断方法，能够识别LDCT发现的可能需要手术干预的结节患者，并提高肺癌的早期检出率。根据Lung-RADS指南，使用蛋白质微阵列，纳入42例有需要手术干预适应症和20例无需干预的实性肺结节队列，我们一共测试了501个肺癌抗体指标。然后在Luminex平台上对26个优势的肺癌抗体指标进行定量分析。入组了841例患者，包括良性肿瘤（BN；n = 101），早期非小细胞肺癌（NSCLC；n = 245），肺内其他早期恶性肿瘤（n = 29），以及符合美国预防性筛查工作组（USPSTF）筛查纳入标准，具有手术指征的肺结节患者（n = 87）和无需干预（n = 379）的结节患者。这841名患者被随机分为三组:训练组、验证组1和验证组2。

　　在测试的26个候选肺癌抗体标志物中，17个肺癌抗体具有区分有手术指征结节患者和无需干预结节患者的性能。我们建立了由6种相关抗体（Annexin 2、DCD、MID1IP1、PNMA1、TAF10、ZNF696）组成的组合，以优化对患者的分类能力；在验证队列1和验证队列2中，阳性预测值（PPV）分别为61.4%/61.0%，阴性预测值（NPV）分别为95.7%/83.9%。该小组可以帮助优化肺癌筛查的方法选择，大大降低无效筛查率，增加普通健康人群的接受程度。

01 研究背景

　　导致非小细胞肺癌患者预后特别差的一个关键因素是，几乎一半的非小细胞肺癌病例直到晚期才被发现。虽然LDCT扫描的灵敏度为93.7%，但它们的假阳性率很高。只有3.6%的初始阳性扫描最终被分类为肺部恶性肿瘤。按照相对严格的标准，LDCT适用于特定的患者，特别是那些有20包年吸烟史，年龄在50-80岁之间，目前仍在吸烟或在过去15年内戒烟的患者。如果仅根据吸烟状况，估计至少有一半被诊断为肺癌的患者不符合筛查标准。另一方面，即使在符合筛查条件的人群中，依从性非常低，估计为4-14%。筛查率可能因患者所在地区和社会经济状况而有很大差异。

　　在最新的筛查建议中，美国预防服务工作组（USPSTF）指出，需要能够识别肺癌高危患者并降低假阳性率的生物标志物。为此，我们的实验室确定了可作为分子指标的肿瘤自身抗体生物标志物，以识别可能具有临床意义“需要手术”的实性肺结节的个体。根据Lung-RADS v1.1和v2022的定义，需要手术的结节是由不小于6 mm实性肺结节组成。相应的这些患者被认为是肺癌的高危人群，我们建议他们更频繁地进行筛查。一项研究发现，约80.6%的患者有临床“无需干预”的结节，发展为肺癌的风险较低（＜0.1%）。相比之下，“不确定”结节（6mm≤结节＜ 8mm）患者的肺癌风险为0.9%，LDCT阳性（结节≥8mm）患者的肺癌风险为9.6%。通过生物标志物测试，我们可以识别出临床上需要手术干预的结节患者群体，我们可以确定哪些患者将从LDCT扫描中获益最多。血液检查的便捷性，可能会增加普通健康人群对筛查的接受程度，也能够帮助到那些对筛查犹豫不决的人，因为开发血液检测标志物可以在初级保健中进行，并有助于降低假阳性率。

　　本研究的重点是寻找一组循环自身抗体生物标志物来满足这一临床需求。我们从使用高通量蛋白质微阵列识别具有临床需要手术干预和无需干预结节患者差异信号的候选抗体生物标志物开始。然后，这些候选抗体生物标志物与其他潜在的生物标志物一起进行评估，并在更大的患者队列中使用定制的Luminex检测。然后进一步确定相关抗体生物标志物的最佳组合，以识别需要手术干预和无需干预的结节，这可以作为与当前肺癌筛查方案相结合的风险分层方法。

02 样本人群

　　所有血清样本均来自拉什大学癌症中心生物库。该设施在Rush IRB的完全批准下运行，本研究中生物标本采集前均已获得所有患者书面知情同意。在LDCT筛查后、手术干预或治疗前，收集本研究中所有患者的全血样本。所有样本由训练有素的抽血师使用红顶抽血器采集，并按标准技术离心处理，在- 80°C冷冻库中保存，用于提取评估。所有样本均于2013-2019年期间收集。根据解剖切除获得的组织的病理诊断，将肺恶性或良性的病例进行分类。高危筛查队列由符合USPSTF指南的肺癌筛查资格但在抽血时没有肺癌的患者组成。本研究中纳入的患者样本反映了在伊利诺伊州芝加哥拉什大学医学中心接受良/恶性结节筛查或手术切除的“真实世界”患者群体。在患者选择过程中没有应用其他组织学或分子标准，因此，本研究评估的人群实际上是随机的。

　　为了本研究的目的，收集了两个单独的队列。第一个是发现队列（n = 62），在我们的实验中用于通过HuProt微阵列识别新的候选生物标志物（图1，步骤1）。第二个队列我们称为生物标志物开发队列（n = 841），如图1，步骤2所示。该队列随机分为训练组（n = 565）、验证组1 （n = 93）和验证组2 （n = 183；也称为“测试”组），用于寻找和验证根据结节是否需要手术干预对患者进行分类的标志物组成，如图1，步骤3所示。

03 研究结果

　　优先选择满足以下条件的候选肺癌抗体标志物：（1）与腺癌高风险或是鳞癌高风险相关；（2）经校正后p值显著，（3）在一种以上的归一化方法中表现突出，（4）相比无需干预组，在需要手术干预组中含量增加。

　　基于这些标准，选择了8个候选肺癌抗体标志物（GPBP1, HNRNPD, NAT9, PNMA1, RAB27A, TAF10, Ubiquillin 2, ZNF696）进行研究，基于区分“需要手术干预”和“无需干预”结节的能力，这些肺癌抗体的“盒状和须状”图（或箱状图）如图2所示。

　　为了最大限度地扩大该研究对肺癌抗体标志物的覆盖范围，我们评估了18个额外的肺癌抗体标志物，我们的实验室发现这些标志物与肺癌的早期检测有相关性。因此，我们在患者队列中总共测试了26种肺癌抗体标志物。最终通过微阵列筛选出8个候选的肺癌抗体，用于区分需要手术干预与无需干预的结节患者，如表1所示。

3.2寻找肺癌抗体标志物，为患者结节分类提供依据

　　在所测试的26个肺癌抗体标志物中，17个对于区分需要手术干预病例和无需干预病例具有显著意义，p值< 0.05。具体观察利用HuProt微阵列发现的8个优选的肺癌抗体标志物（GPBP1, HNRNPD, NAT9, PNMA1, RAB27A, TAF10, Ubiquillin 2, ZNF696）用于识别需要手术干预和无需干预结节的性能，其中7个具有显著性，p值< 0.05。表2列出了所有测试的26种生物标记物的性能，而图3显示了前10种最重要标记物的箱线图。

3.3最佳肺癌抗体标志物的性能表现

　　为了进一步评估个体肺癌抗体标志物的表现，我们将其分为临床不同的队列:良性队列、恶性队列或高风险筛查队列。按分类总准确率划分为前五个最重要的抗体生物标志物（见表3）。对于肺癌，单个肺癌抗体标志物相应的准确率在50-82%之间，其中最好的标志物是HNRNPD。对于组织学良性病例，准确率为44-82%，HNRNPD和MID1IP1均具有82%的需要手术干预分类准确率。最后，对于初筛队列，将样本分类为需要手术干预或无需干预组别的比例为45-68%，其中IMPDH2在生物标志物中准确率最高。

3.4 患者风险启动最终优化组合的性能

　　最后，我们评估了肺癌抗体标志物在高风险筛查队列中的表现。在本研究评估的无需干预病例中，高危筛查病例占大多数。在筛查队列中，51.1%的队列被正确分类为需要手术干预或无需干预的结节。这些肺癌抗体标志物在具有需要手术干预结节的筛查队列中的表现很好，验证1和验证2中有21/23个样本被正确分类。在无需干预的结节筛查队列中，表现较差，只有48/112例正确分类为无需干预。这可能是由于该小组为识别需要手术干预的结节而进行了优化，由于其他检测机制的可用性，假阳性的比例降低了。此外，对于64例错误分类的无需干预病例中的56例，随后进行LDCT检查并评估。在随后的检查中，6/56有需要手术干预的结节。考虑到这些病例，这可能会将该测试在验证1队列中的特异性提高到54.5%，在验证2队列中提高到41.7%。

04 结论

　　本研究已经确定了可用于识别需要手术干预与无需干预结节的肺癌抗体标志物。最后，我们选择了一个肺癌抗体标志物组合（Annexin 2、MID1IP1、PNMA1、TAF10和DCD），具有高灵敏度（验证1为97.2%，验证2为93.5%），用于识别需要手术干预的结节患者。

　　在符合条件的筛查人群中，只有约10-20%的人有需要手术干预的肺结节。与其他高危筛查人群相比，需要手术干预结节患者患肺癌的风险高9-96倍。据估计，无需干预结节的高危人群的肺癌发病率与不吸烟者相似，为0.1%；估计女性为0.1%，男性为0.2%。这表明我们的肺癌抗体标志物测试可以在普通筛查人群中识别出一小部分（10-20%）将受益于LDCT的人群。而其他大多数筛查人群可能只需要每年进行一次肺癌抗体标志物血液检测，这是一种简单、经济且更容易获得的方法。

　　这组肺癌抗体标志物可能有助于改善目前的早期肺癌筛查模式。未来，将对高风险人群组成的更大样本人群进行更多的验证研究，有助于对该组肺癌抗体标志物进行优化。